Принцип действия полигексаметиленбигуанида гидрохлорида (ПГМБ)
Антибактериальнные препараты VANTOCIL содержат в своей основе полигексаметиленбигуанид гидрохлорид (также известный как ПГМБ). ПГМБ как бактерицидный агент широкого спектра действия является активным веществом в ряде антибактериальных препаратов VANTOCIL. При относительно низких концентрациях бактерицидное действие вещества бактериостатично; при более высоких концентрациях - резко бактерицидно.
ПГМБ может быть представлен общей структурной формулой:
Анализ бактериальной клетки
Чтобы понять принципы антибактериального действия ПГМБ, следует рассмотреть структуру и функционирование клетки.
Рис. 1 показывает, как связываются биохимические компоненты в различных слоях обычной клетки грамположительной бактерии.
Наружная мембрана встречается только у грамотрицательных видов, например Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa. Она выполняет роль молекулярного фильтра, защищающего цитоплазматическую мембрану от разрушающих токсинов. Чтобы подействовать на клетку, антибактериальный препарат должен проникнуть через этот слой. Под ним находится привязанная к нему клеточная оболочка, которая не только обеспечивает клетке форму и прочность, но и дает ей возможность противостоять высокому внутреннему осмотическому давлению.
Под клеточной оболочкой, или пептидогликановым слоем, находится цитоплазматическая мембрана, которая со всех сторон окружает цитоплазму. Вследствие селективности, с которой она пропускает внутрь клетки вещества, эта мембрана поддерживает в цитоплазме определенные концентрации ионов, транспортируемых туда под влиянием электрохимических процессов: вследствие разного уровня рН и потенциала по разные стороны мембраны. Помимо описанной барьерной функции, цитоплазматическая мембрана содержит в себе множество важных для функционирования клетки белков, в т. ч. энзимов, которые входят в состав гомогенных фосфолипидов, из которых и состоит мембрана.
Рисунок 1: Клеточная оболочка и структура мембраны обычной грамотрицательной бактерии в разрезе, на молекулярном уровне.
Экспериментальная часть
Исследования механизмов, благодаря которым ПГМБ проникает через защитные слои бактериальной клетки и обезвреживает ее, проводились с применением нескольких методов. Большинство экспериментальных процедур, о которых идет речь в данном документе, подробно описаны в специальной литературе; источники перечислены в библиографической части.
Взаимодействие с наружной мембраной бактериальной клетки
Характерная особенность бактериальной клетки - отрицательная заряженность. Природа ионогенных групп зависит от вида бактерии. Начальное взаимодействие ПГМБ с рядом видов бактерий отслеживалось с применением микроэлектрофореза. Исследование показало, что при наличии достаточного количества ПГМБ поверхностный заряд бактериальной клетки очень быстро нейтрализуется, переходя затем в противоположный. Уровень обращения заряда пропорционален концентрации ПГМБ и достигает устойчивого равновесия уже через пять минут. Резкое электростатическое притяжение катионного ПГМБ и отрицательно заряженной бактериальной клетки, вне всяких сомнений, способствует быстрому ее уничтожению под действием ПГМБ. Электронные микрографии и исследования типичных компонентов наружной мембраны (в т. ч. 2-кето-3-деоксиоктонат - KDO) показывают, что сублетальные концентрации ПГМБ приводят к нелетальным изменениям в целостности наружной мембраны грамотрицательных клеток. Отток двухвалентных катионов, особенно ионов кальция (Ca2+), происходит до или во время указанных изменений в мембране. Эти катионы играют важную роль в связывании наружной оболочки и структурного пептидогликана. Предполагается, что ПГМБ конкурирует с негативными участками пептидогликанового слоя, приводя к замещению катионов металлов. Вследствие нарушения целостности наружной мембраны клетка становится подверженной воздействию ПГМБ, остающегося в растворе.
Взаимодействие с цитоплазматической мембраной
С точки зрения последовательности стадий уничтожения бактериальной клетки ее цитоплазматическая мембрана является важным местом действия. Немногие имеющиеся данные позволяют предположить, что биохимия цитоплазматической мембраны мало различается от вида к виду бактерий, однако может зависеть от условий их роста. При воздействии на бактерии бактериостатическими и бактерицидными количествами ПГМБ наблюдались определенные изменения, которые указывают на повреждение цитоплазматической мембраны. Так, протекание цитоплазматического содержимого является классическим индикатором таких повреждений. На первом этапе (при последующем увеличении концентраций ПГМБ) наблюдается утечка молекул с низким молекулярным весом, в первую очередь ионов калия. Уже при бактериостатических количествах ПГМБ из клетки уходит около 40% содержащихся в клетках K+. Электронные микрографии этих обработанных до сублетальности клеток показывают сокращение или плазмолиз бактериального протопласта, т. е. цитоплазмы и остающейся мембраны. Клетки, которые были подвергнуты воздействию бактеристатического количества ПГМБ, могут вернуть свои жизненные свойства, несмотря на утрату до 40% K+. При подобных бактериостатических обработках наблюдается подавление мембранных энзимов, например, аденозинтрифосфатаз.
С увеличением концентрации ПГМБ содержимое клетки с большим молекулярным весом (например, нуклеотиды) поступает в надосадочную жидкость вокруг нее. На этом этапе клетки уже больше не непроницаемы для красящих веществ, в т. ч. для TNS (2-толуидинил-6-нафталинсульфоновой кислоты), которая способна конъюгировать с протеинами цитоплазмы, заставляя клетки флуоресцировать под УФ-лучами. Бактериальные клетки со значительной (более 15% выше нормального уровня) утечкой нуклеотидов оказываются неисправимо поврежденными; следственно, подобные количества ПГМБ являются бактерицидными. Уровень разрушения мембраны, а значит и бактерицидности, возрастает с увеличением концентрации ПГМБ до точки, в которой уровень утечки цитоплазматического содержимого возвращается к уровню до проведения обработки. Исследование под электронным микроскопом показывает, что цитоплазма этих клеток осаждается химическим образом, препятствуя вытеканию содержимого клетки. Как было доказано, такое осаждение является следствием взаимодействия полимерного ПГМБ и нуклеиновых кислот цитоплазмы.
Изменения, ведущие к летальному действию
Описанная выше последовательность позволяет предположить, что летальное действие ПГМБ заключается в необратимом разрушении важных клеточных компонентов вследствие повреждения цитоплазматической мембраны. Отсюда следует вывод: осаждение цитоплазматического содержимого следует за гибелью бактериальной клетки.
Эксперимент показал, что летальная последовательность состоит из ряда цитологических и физиологических изменений (некоторые из которых являются обратимыми), которые приводят к гибели клетки. Эта последовательность включает:
- Резкое притягивание к поверхности бактерии;
- Связывание с рецептивным участком на поверхности;
- Преодоление механизмов бактериальной защиты / исключения;
- Притягивание к цитоплазматической мембране;
- Вытекание компонентов цитоплазмы с низким молекулярным весом, например, K+, и подавление содержащихся в мембране энзимов, например, аденозинтрифосфатаз;
- Обширное разрушение цитоплазматической мембраны, вытекание макромолекулярных компонентов, например, нуклеотидов;
- Осаждение содержимого клетки.
Выводы о молекулярном взаимодействии ПГМБ и мембран бактериальных клеток были сделаны путем наложения данной летальной последовательности на результаты экспериментов по моделированию возможного взаимодействия полимерных бигуанидов и компонентов мембраны - в частности, фосфолипидов.
Состав биомембраны
В настоящий момент в науке принята модель, разработанная Зингером и Николсоном (1972 г.), которые предположили, что биомембраны состоят из жидкого фосфолипидного двойного слоя, в котором движутся глобулярные белки. Фосфолипиды могут быть нейтральными, как фосфатидил-этаноламин, или кислыми, как фосфатидил-глицерол. Кислые фосфолипиды, несмотря на то, что они присутствуют в мембране в малых количествах, выполняют две очень важные функции:
- Расширяют или разжижают структуру мембраны за счет
бокового отталкивания;
- Предотвращают утончение или сплющивание указанных двух двойных слоев за счет электростатического отталкивания двух плоскостей.
Нарушение одной из этих функций ведет к нестабильности мембраны. Деятельность функциональных протеинов, входящих в состав мембраны, напрямую зависит от небольшого количества связанных или пограничных фосфолипидов, поэтому любые изменения в их составе ведут к утрате данными протеинами (в т. ч. аденозинтрифосфатазами) их функций. Двухвалентные катионы (кальция и магния, например), очевидно, играют важную роль в поддержании равновесия в мембране.
Исследования сродства
Исследования фосфорных31 ЯМР-спектров подтвердили прогнозируемый результат: катионный бигуанид обладает большим сродством с кислыми фосфолипидами (например, фосфатидил-глицеролом), чем с нейтральными фосфолипидами (например, фосфатидилл-этаноламином), и при наличии тех и других бигуанид будет преимущественно связываться с первыми. В моделях мембран, содержащих смесь двух указанных фосфолипидов, ПГМБ выбирает кислые и индуцирует фазовое разделение фосфолипидов двух указанных типов, что приводит к дестабилизации, о которой свидетельствует деполяризация флуоресценции. В конечном итоге разделенные фосфолипиды принимают энергетически более благоприятную гексагональную фазу, что ведет к полной утрате барьера проницаемости. Дополнительно это взаимодействие характеризуется следующей тенденцией: оно концентрируется вокруг любых участков мембраны с максимальной плотностью заряда. Как показали эксперименты, такие участки состоят из цельных протеинов. Это значит, что начальное взаимодействие на сублетальном уровне может концентрироваться вокруг этих протеинов, что ведет к нарушению их функций в силу изменений в пограничном фосфолипидном окружении. Экспериментально это было доказано на таких энзимах, как аденозинтрифосфатазы при сублетальных концентрациях ПГМБ.
Пространственное взаимодействие
Исследование вероятного пространственного взаимодействия ПГМБ и молекул фосфолипидов показывает, что метиленовая последовательность, разделяющая бигуанидные группы, может выступать в роли вставки (инсерта) в гидрофобном внутреннем слое мембраны. Это стабилизирует связь между заряженной головной группой фосфолипидов и делокализованным позитивным зарядом бигуанидных групп ПГМБ (см. рис. 2.2 и 2.3). Такая связь приводит к дестабилизирующему разделению головных групп фосфолипидов. Тот факт, что катионная доля полимеризуется, означает, что подобное влияние будет накапливаться, особенно при локализации рядом с глобулярным протеином на поверхности мембраны. Вероятная последовательность событий, ведущих к необратимому разрушению цитоплаз-матической мембраны, показана в предлагаемом механизме.
Предлагаемый механизм действия ПГМБ
Рисунок 2.1: Бактериальная цитоплазматическая мембрана, соответствующая модели жидкой мозаики; стабилизируется ионами кальция и фосфолипидной смесью и распределением.
Рисунок 2.2: Первая порция ПГМБ замещает поверхностные катионы, соединяется с кислыми фосфолипидами, приводя к изменениям в упаковке.
Рисунок 2.3: ПГМБ индуцирует фазовое разделение фосфолипидов - действие, которое концентрируется на участках цельных протеинов; повышает проницаемость мембраны, ведет к оттоку ионов K+, утрате энзимами своей функции, т. е. к бактериостатическому уровню воздействия.
Рисунок 2.4: Дестабилизированные области формируют более удобную гексагональную фазу, надстраиваясь на избыточный ПГМБ (электростатический и гидрофобный); полная утрата мембраной своей функции, т. е. бактерицидный уровень воздействия.
Безопасное использование биоцидов. Перед использованием необходимо прочесть ярлык и информацию о продукте.
Некоторые из биоцидов, производимых компанией Arch Chemicals, Inc., могут быть не зарегистрированы в Вашей стране для определенных целей использования.
Любые данные касательно тест-микроорганизмов, упомянутых в данном документе, относятся к стандартным лабораторным культурам, и предоставляются исключительно в информативных целях. Включение указанных данных в этот документ не является гарантией уничтожения болезнетворных организмов при применении вещества и не подразумевает ее.
|
